UJI TEA EXTRACT (B) BG

Новая концепция предупреждения старения: ингибирование калпаина с целью блокирования чрезвычайно опасной “поздней стадии” окислительного стресса в клетках кожи.

Хорошо известно, что в результате УФ - облучения образуются реактивные формы кислорода (РФК), которые вызывают различные повреждения в клетках кожи. Доказано, что после УФ-облучения повышается активность матричных металлопротеиназ (ММП-1), разрушающих существующий коллаген, и уменьшается синтез нового коллагена, в результате окисления происходит нарушение нативной конформации белков. Процессы, связанные с действием РФК и именуемые "окислительным стрессом", могут приводить к необратимым клеточным изменениям, воспалению, образованию морщин и, как следствие, старению кожи.

Новейшие исследования японских ученых показали, что окисление в человеческих клетках кожи, спровоцированное УФ - облучением, протекает в два этапа. Первая фаза продукции реактивных форм кислорода (РФК) наблюдается в течение 1ч после УФ - экспозиции, и это – основная волна окислительного стресса, для коррекции которой используется большинство известных антиоксидантов.
Тем не менее, через 7ч после облучения в клетках наблюдался второй всплеск продукции РФК, предопределяя вторую, «позднюю фазу», оксидативного стресса (Рис.1). Исследования подтвердили, что «поздняя фаза» окислительного стресса наносит серьезный вред клеткам кожи и приводит со временем к таким кожным проблемам, как воспаление, пигментация и морщины.

УФБ - облученные клетки помещали на 30 мин. с 20 μM H₂DCFDA (реактивом для определения активных форм кислорода в клетке, который при окислении превращается в интенсивно флуоресцирующее вещество) и каждый раз инкубировали в течение 30 мин. РФК в клетке измеряли по интенсивности флуоресценции (Ex: 485 нм/Em: 530 нм) клеточных лизатов. Статистическая значимость*<0.05.

рис.1 Динамика продукции реактивных форм кислорода во времени после УФБ облучения

Ученые выяснили, что вторая волна продукции реактивных форм кислорода связана с интерлейкином-1 альфа (ИЛ-1α)- воспалительным цитокином, обеспечивающим мобилизацию воспалительного ответа.(рис.2,3)

Клетки подвергли УФБ - облучению (25 мДж/см²). Секретированное в культуральную среду количество IL-1α определяли при помощи иммуносорбентного ферментного анализа (ELISA assay), набора реагентов «Quantikine Human IL-1α Immunoassay». Статистическая значимость*<0.05, **<0.01.

Рис.2 Зависимость секреции ИЛ-1α от времени после УФБ облучения

Рис.3 Образование реактивных форм кислорода как следствие продукции IL-1α

Клетки поместили с 20 μM H₂DCFDA на 30 мин, после чего инкубировали в течение 30 мин. с 10 нг/мл IL-1α. Реактивные формы кислорода в клетке определяли по интенсивности флуоресценции(Ex: 485 нм/Em: 530 нм) клеточных лизатов. Статистическая значимость*<0.05, **<0.01.

Далее было установлено, что синтез IL-1α, за которым следовала генерация РФК, индуцировался калпаином. Калпаин - это цистеиновая протеаза, фермент, действующий в клетках в качестве регулятора и активируемый ионами кальция. Он обнаруживается во многих частях организма. О роли калпаина в процессе старения уже опубликовано несколько медицинских докладов. Исследования показали, что после УФБ - облучения клеток активность калпаина возрастает (Рис. 4)

Рис.4 Повышение активности калпаина после УФБ – облучения

Облученные (25 мДж/см²) клетки, помещенные с 10 μM субстрата Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, специфичного к калпаину, каждый раз в течение 1ч (1, 2, 3, 4 и 6 ч) лизировали и определяли выраженность флуоресценции (Ex: 380 нм/Em: 460нм). *<0.05, **<0.01

Калпаин напрямую связан с «поздней стадией» окислительного стресса в клетках кожи. При нормальном состоянии клетки он неактивен. Повышение внутриклеточной концентрации свободного Са2+ выше пороговой величины приводит к активации калпаина. Калпаин экспрессируется примерно через 2-3 часа после УФ-облучения и запускает секрецию IL-1α, заканчивающуюся приблизительно через 7ч после первичной УФ-экспозиции. За секрецией IL-1α немедленно следует вторая волна продукции реактивных форм кислорода (Рис.5,6)

Рис.5 Двухфазный процесс образования реактивных форм кислорода после УФБ - облучения

Рис.6 Калпаин: активация секреции IL-1α

Рис.7 Участие Ca²⁺ в цепочке процессов, запускающих продукцию реактивных форм кислорода

В лабораторных условиях активность калпаина блокировалась ингибитором протеаз - ALLN (N-Acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal). После предварительной обработки клеток этим реагентом в течение 1ч, клетки подвергли УФБ-облучению (25 мдж/см²). Активацию протеазы определяли через 2ч после УФ-экспозиции. Уровень выживаемости клеток оценивали по введенному красителю нейтральному красному. Продукцию реактивных форм кислорода измеряли через 7ч после УФБ - облучения (Рис. 7). Статистическая значимость; *<0.05, **<0.01.

Рис.8 Воздействие ингибитора калпаина (ALLN) на УФБ - индуцированные реакции

• Поздняя фаза оксидативного стресса вызывает повреждения в УФБ - облученных
  клетках
• Через 5ч после УФБ - экспозиции клетки начинают секретировать IL-1α
• IL-1α стимулирует продукцию реактивных форм кислорода
• УФБ - облучение индуцирует быструю активацию калпаина
• Ингибитор калпаина снижает продукцию реактивных форм кислорода, запущенную
  УФБ - облучением

Эти исследования убедительно доказывают участие калпаин – IL-1α – каскада в генерации реактивных форм кислорода в облученных кератиноцитах во время второй стадии окислительного стресса.
После теоретических исследований, задачей которых было изучить механизмы, лежащие в основе двухфазного протекания окислительного стресса в клетках кожи после УФБ - облучения, перед учеными была поставлена задача идентифицировать натуральный ингредиент, который способен блокировать выявленные биохимические процессы, неизбежно ведущие к фотостарению.
С этой целью ученые провели скрининг множества растительных экстрактов на предмет ингибирования активности калпаина.

Скрининг веществ растительного происхождения на предмет ингибирования калпаина

IC₅₀ является количественным индикатором, который показывает, сколько нужно лиганда—ингибитора для ингибирования биологического процесса на 50 %.

• Предыдущее исследование определило, что ранее неизвестная каскадная реакция с вовлечением калпаин-IL-1α непосредственно связана с продукцией реактивных форм кислорода в УФБ-облученных кератиноцитах.
• Чтобы блокировать этот каскад, было протестировано множество растительных ингредиентов, способных ингибировать калпаин.
• В качестве эффективного ингредиента, способного подавлять активность калпаина,
  был обнаружен Uji Tea extract. Исследования подтвердили, что этот экстракт способен
  защитить клетки от повреждений, вызванных калпаин-IL-1α каскадом, инициированным
  УФБ- облучением.

На кожу предплечья восьми испытуемым наносили тестируемые средства (в виде крема), содержавшие в составе UJI TEA EXTRACT (B)-BG в концентрации 1%, 2% и 3% и плацебо (таблица ниже)

После аппликации крема соответствующие участки кожи облучали дозой в 1.5 МЭД (УФА+УФБ), используя симулятор УФ-излучения солнца Multiport Solar UV Simulator Model 601.
Сразу же после облучения тестируемые крема нанесли повторно и через 24 ч после УФ - экспозиции оценили уровень покраснения (Рис.10)

Рис. 10 Результаты In vivo теста : уменьшение очага воспаления, индуцированного УФ- облучением.

Метод: на кожу предплечья испытуемых апплицировали тестируемые средства (в виде крема), после чего облучили дозой в 1.5 МЭД (УФА+УФБ), используя симулятор УФ-излучения солнца Multiport Solar UV Simulator Model 601.
Сразу же после облучения тестируемые крема нанесли на эти участки кожи повторно. После этого теста крема наносились дважды в день в течение 4 недель. Через 4 недели со всех участков делали соскоб корнеоцитов клейкой лентой и определяли соотношение IL-1Ra/IL-1α, отражающее активность и тяжесть патологического процесса (Рис.11)

Рис. 11 Уменьшение показателя IL-1Ra/IL-1α в корнеоцитах
*IL-1Ra/IL-1α –это соотношение продукции интерлейкина-1α (IL-1α) и интерлейкин - 1-рецепторного антогониста (IL-1Ra).

• Uji Tea Extract (B)-BG ингибирует экспрессию калпаина
• Подавляет развитие повреждений в клетке и уменьшает эритему, индуцированную
  УФБ- облучением через блокирование калпаин-ИЛ-1α каскада реакций
• Уменьшает соотношение интерлейкин-1α (IL-1α)/ интерлейкин - 1-рецепторный
  антогонист (IL-1Ra) в клетках рогового слоя

UJI TEA EXTRACT получен из листьев растения Camellia sinensis (семейство Theaceae), которое служит сырьем для производства чая. По чайной классификации чай Uji (Уджи) относится к неферментированным, т.е. зеленым. Чайные листья для производства этого чая культивируются только в четырех префектурах Японии: Киото, Нара, Сига и Миэ и обрабатываются в Киото вручную традиционным способом (рисунок ниже).

Свыше 800 лет чай Уджи считался «напитком знати» и в настоящее время относится к классу премиальных чаев.
Его приобретают в качестве праздничного подарка или сувенира из областей Киото.

На основе полученных данных, подтверждающих ингибирование опасной поздней стадии окислительного стресса, вызванного УФ-облучением, экстрактом чая UJI, а также клинических испытаний, подтвердивших реальное уменьшение воспаления, представляется весьма перспективным исползование UJI TEA EXTRACT (B)-BG в различных косметических средствах для защиты и ухода за кожей лица и тела.

• В антивозрастных средствах, в которых использование uji tea extract призвано замедлить процессы фотостарения кожи, а также выступить эффективным антивоспалительным агентом
• В защитной косметике для загара, где uji tea extract способен замедлить или блокировать негативные реакции, спровоцированные пребыванием на солнце
• Учитывая, что uji tea extract уменьшает эритему, индуцированную уф - лучами, он успешно может применяться в средствах по уходу за кожей после загара для снятия воспаления