Противокариесное действие Экстракта Лакричника А.М.

Принцип действия

Точка приложения и ингибирующее влияние на развитие кариеса.

Тесты in-vitro (собственные тесты)

Антимикробная активность

Методика тестирования

Для проведения данного исследования использовали методику серии разведений с последующей инкубацией. 250 мг ЭКСТРАКТА ЛАКРИЧНИКА А.М. растворяли в 5 мл 70% этилового спирта, затем доводили общий объем до 10 мл.

Полученный раствор содержал максимальную концентрацию тестируемого вещества. Далее делали серию разведений, уменьшая количества экстракта А.М. в каждом образце в 2 раза. В качестве растворителя брали 50% этиловый спирт.

9.8 мл BHI (brain heart infusion) питательной среды (Nissui Pharmaceuticals) в пробирке для проведения эксперимента автоклавировали 15 минут при 120°С. К обработанной питательной среде добавляли по 100 мкл раствора Экстракта Лакричника А.М. в этиловом спирте в полученных концентрациях и хорошо перемешивали. После чего добавляли 100 мкл суспензии клеток Streptococcus mutans, которую предварительно инкубировали в BHI питательной среде 12 часов при 37°С. После двух дней инкубации определяли МИК (минимальная ингибирующая концентрация), визуально оценивая бактериальный рост в тестируемых образцах.

Результат

Кариесогенный стрептококк (серотипы)

Периодонтальные бактерии

Анти-GT активность

Методика тестирования

1,000 мкл базового раствора (2% раствор сахарозы, содержащий 0.1% NaN₃), 50 мкл тестируемого раствора (в случае холостой пробы, раствор тестируемого вещества заменяли на 50 мкл 50% этилового спирта), 900 мкл дистиллированной воды и 50 мкл раствора неочищенной GT (глюкозилтрансфераза) (в случае холостой пробы, раствор GT заменяли на 50 мкл дистиллированной воды) смешивали в пробирке. Смесь инкубировали 5 часов при 37°С и измеряли оптическую плотность при длине волны 550 нм.

Результат

Подавление образования зубного налета

Методика тестирования

ЭКСТРАКТ ЛАКРИЧНИКА А.М. растворяли в 50% этиловом спирте, 50% этиловый спирт использовали как холостую пробу. Пробирку для эксперимента взвешивали, заполняли 5.35 мл BHI питательной среды, содержащей 2% сахарозы, и автоклавировали. После охлаждения добавляли 0.15 мл тестируемого раствора и 0.5 мл предварительно культивированной суспензии Streptococcus mutans 6715. Смесь инкубировали 14 часов при 37°С.

После инкубации раствор из пробирки осторожно сливали, пробирку трижды промывали очищенной водой и сушили 5 часов при 105°С. Определяли конечный вес зубного камня, который прилип к стенкам пробирки. Коэффициент образования зубного налета рассчитывали, принимая коэффициент образования зубного налета в холостой пробе за 100%.

Результат

Противокариесное действие Экстракта Лакричника А.М. в различных растворителях

Цель эксперимента

Данное исследование проводили с целью оценить влияние различных растворителей на биологическую активность Экстракта Лакричника А.М. в предотвращении кариеса.

Антимикробная активность

Методика тестирования

Бактериальный штамм — Streptococcus mutans IFO 15355

Приготовление тестируемых растворов

• Раствор в глицерине
  40 мг Экстракта Лакричника А.М. суспендировали в 1 гр. нагретого до 70°С глицерина. Для достижения однородности суспензии смесь обрабатывали ультразвуком и перемешивали миксером.

• Раствор в 70% пропиленгликоле
  40 мг Экстракта Лакричника А.М. суспендировали в 1 гр. пропиленгликоля и солюбилизировали ультразвуком.

• Раствор в 70% этиловом спирте
  40 мг Экстракта Лакричника А.М. суспендировали в 1 гр. 70% этилового спирта и солюбилизировали ультразвуком.

Процедура тестирования

100 мкл тестируемого раствора и 10 мл стерилизованного BHI бульона (Nissui Pharmaceuticals Co., Ltd) смешивали в пробирке. Предварительно культивированные бактерии добавляли к вышеописанной смеси и инкубировали 16 часов при 37°С. После чего визуально оценивали помутнение тестируемого раствора.

Результат

Анти-GT активность

Приготовление тестируемых растворов

• Раствор в глицерине
  40 мг Экстракта Лакричника А.М. суспендировали в 1г нагретого до 70°С глицерина. Для достижения однородности суспензии смесь обрабатывали ультразвуком и перемешивали миксером.

• Раствор смеси глицерин : 70% этанол = 9:1
  40 мг Экстракта Лакричника А.М. суспендировали в 0.1 г 70% этилового спирта. К суспензии добавляли 0.9 г нагретого до 70°С глицерина. Для достижения однородности суспензии смесь обрабатывали ультразвуком и перемешивали миксером.

• Раствор в 70% пропиленгликоле
  40 мг Экстракта Лакричника А.М. суспендировали в 1г 70% этилового спирта и солюбилизировали ультразвуком.

Процедура тестирования

1,000 мкл базового раствора (2% раствор сахарозы, содержащий 0.1% NaN3), 50 мкл тестируемого раствора (в случае холостой пробы, раствор тестируемого вещества заменяли на 50 мкл 50% этилового спирта), 900 мкл дистиллированной воды и 50 мкл раствора GT (в случае холостой пробы, раствор GT заменяли на 50 мкл дистиллированной воды) смешивали в пробирке.

Смесь инкубировали 5 часов при 37?С и измеряли оптическую плотность при длине волны 550 нм. Неочищенную GT (гуанилилтрансфераза) для данного эксперимента получали из раствора Streptococcus mutans 6715.

где, A — Культура клеток, содержащая GT + субстрат + растворитель; В — Культура клеток, содержащая воду + субстрат + растворитель; С — Культура клеток, содержащая GT + субстрат + тестируемый образец; D — Культура клеток, содержащая вода + субстрат + тестируемый образец.

Результаты

Подавление образования зубного налета

Приготовление тестируемых растворов

• Раствор в глицерине
  40 мг Экстракта Лакричника А.М. суспендировали в 1г нагретого до 70?С глицерина. Для достижения однородности суспензии смесь обрабатывали ультразвуком и перемешивали миксером.

• Раствор смеси глицерин : 70% этанол = 9:1
  40 мг Экстракта Лакричника А.М. суспендировали в 0.1 г 70% этилового спирта. К суспензии добавляли 0.9 г нагретого до 70?С глицерина. Для достижения однородности суспензии смесь обрабатывали ультразвуком и перемешивали миксером.

• Раствор в 70% пропиленгликоле
  40 мг Экстракта Лакричника А.М. суспендировали в 1г 70% этилового спирта и солюбилизировали ультразвуком.

Процедура тестирования

Пробирку для эксперимента взвешивали, заполняли 5.35 мл BHI питательной среды, содержащей 2% сахарозы, и автоклавировали. После охлаждения добавляли 0.15 мл тестируемого раствора и 0.5 мл предварительно культивированной суспензии Streptococcus mutans 6715. Смесь инкубировали 14 часов при 37°С. После инкубации, раствор из пробирки осторожно сливали, пробирку трижды промывали очищенной водой и сушили 5 часов при 105°С. Определяли конечный вес зубного камня, который прилип к стенкам пробирки.

где, А — Контрольная пробирка после просушивания при 105°С; В — Контрольная пробирка до начала тестирования; С — Пробирка с тест-раствором после просушивания при 105°С; D — Пробирка с тест-раствором до начала тестирования.

Результаты

Заключение

Данное исследование показало, что биологическая активность Экстракта Лакричника А.М. в предотвращении кариеса не зависит от типа растворителя.

Эффективность зубной пасты, содержащей Экстракта Лакричника А.М., против кариеса

Объект исследования

• Образец А: Зубная паста, содержащая 1% Экстракта Лакричника А.М.
• Образец В: Зубная паста, не содержащая 1% Экстракта Лакричника А.М.

Рецептура образца А

Периодонтальные бактерии

Рецептура образца B

Подавление образования зубного налета

Методика тестрования

Экстракта Лакричника А.М. растворяли в 50% этиловом спирте, 50% этиловый спирт использовали как холостую пробу. Пробирку для эксперимента взвешивали, заполняли 5.35 мл BHI питательной среды, содержащей 2% сахарозы, и автоклавировали. После охлаждения добавляли 0.15 мл тестируемого раствора и 0.5 мл предварительно культивированной суспензии Streptococcus mutans 6715. Смесь инкубировали 14 часов при 37°С.

После инкубации раствор из пробирки осторожно сливали, пробирку трижды промывали очищенной водой и сушили 5 часов при 105°С. Определяли конечный вес зубного камня, который прилип к стенкам пробирки. Коэффициент образования зубного налета рассчитывали, принимая коэффициент образования зубного налета в холостой пробе за 100%.

Анти-GT активность

Методика тестирования

Исследование проводили в двух группах для каждой зубной пасты. В первой группе использовали тестируемые зубные пасты, вторая группа — холостая проба.

1,000 мкл базового раствора (2% раствор сахарозы, содержащий 0.1% NaN₃), 50 мкл тестируемого раствора (в случае холостой пробы, раствор тестируемого вещества заменяли на 50 мкл 50% этилового спирта), 900 мкл дистиллированной воды и 50 мкл раствора GT (в случае холостой пробы, раствор GT заменяли на 50 мкл дистиллированной воды) смешивали в пробирке. Смесь инкубировали 5 часов при 37°С и измеряли оптическую плотность при длине волны 550 нм.

Результат

Адсорбция Экстракта Лакричника А.М. на зубах

Цель эксперимента

Данное исследование проводили, чтобы оценить адсорбцию Экстракта Лакричника А.М. на зубах. Для этого изучали способность апатита, как основного структурного компонента зубов, адсорбировать Экстракта Лакричника А.М.

Методика тестирования

Избыточное количество Экстракта Лакричника А.М. суспендировали в 40(v/v)% и 20(v/v)% этиловом спирте и фильтровали через 0.45мкм мембранный фильтр. Таким образом получали насыщенные растворы Экстракта Лакричника А.М. в 40(v/v)% и 20(v/v)% этиловом спирте. К 10 мл каждого раствора добавляли по 1 г апатита (Wako Pure Chemical Industries Ltd., использовали апатит для биологических исследований) и оставляли при комнатной температуре на 15 минут, время от времени перемешивая. После чего растворы фильтровали, используя мембранный фильтр. Фильтрованные растворы исследовали с помощью HPLC метода.

Насыщенные растворы Экстракта Лакричника А.М. в 40(v/v)% и 20(v/v)% этиловом спирте без добавления апатита также подвергали HPLC и рассматривали как контроль. Основываясь на коэффициенте адсорбции глабридина (основной компонент Экстракта Лакричника А.М.) рассчитывали коэффициент адсорбции экстракта лакричника на зубах.

Параметры HPLC

• Колонка: WAKOSIL5C18 (4 x 250нм)
• Подвижная фаза: CH3CN:2%AcOH = 3:2
• Детектор: UV282нм
• Скорость потока: 1.7мл/мин

Результат

Тесты in-vivo (Nippon Dental University)

Противокариесное действие

Методика тестирования

Для эксперимента использовали ICR мышей (самцы, возраст 3 недели). Животных делили на группы по 7 мышей в каждой. Мышей кормили соответствующим кормом на протяжении 30 дней. Зубы мышей окрашивали раствором фуксина, чтобы оценить наличие и динамику развития кариеса.

Контроль — корм, который провоцирует развитие кариеса (концентрация сахарозы 30%)

• Тест 1: корм, содержащий 30% сахарозы + 0.025% Экстракта Лакричника А.М.
• Тест 2: корм, содержащий 30% сахарозы + 0.05% Экстракта Лакричника А.М.

Результат

Результаты тестирования приведены в таблице. Степень развития кариеса оценивали следующим образом:

• А — отсутствие кариеса
• В — поверхностный кариес (повреждение зубной эмали)
• С — кариес дентина
• D — обширный кариес дентина с видимым разрушением коронки зуба

Тесты на безопасность

Тест на острую токсичность

Методика тестирования

1. Образец
   Дисперсия Экстракта Лакричника А.М. в оливковом масле

2. Животные
   Мыши, самцы, линия Crj:CD-1(ICR), возраст — 4 недели. Перед началом эксперимента животные проходили акклиматизацию в течение недели, после чего животных делили на группы по 8 мышей в каждой. Животных содержали в помещении, где поддерживали температуру 23 ± 1°С, относительную влажность 55 ± 5%, световой день — 12 часов. Мыши получали корм CRF1(Nippon Charles River Co., Ltd.) и имели свободный доступ к автоматическим поилкам с обычной водопроводной водой.

3. Введение
   Дисперсию Экстракта Лакричника А.М. в оливковом масле вводили орально.

4. Оценка
   После семи дней введения тестируемого образца животных взвешивали и регистрировали смертность. LD50 и предельную погрешность рассчитывали по методу Litchfield-Wilcoxon.

Результат

LD₅₀ > 5,700 мг/кг

Тест на мутагенность

Мутагенность Экстракта Лакричника А.М. проверяли прямым методом и по активности метаболизма, используя штаммы Salmonella typhimurium (ТА98, ТА100, ТА1535 и ТА1537) и Escherichia coli (WP2uvrA). Концентрации Экстракта Лакричника А.М. в эксперименте: 15.6, 31.3, 62.5, 23 и 250 мкг/0.1мл в чашке.

По результатам эксперимента количество ревертантных колоний в присутствии тестируемого вещества практически не отличалось от контроля для всех исследуемых штаммов. Антибактериальный эффект также не был отмечен ни для одной концентрации Экстракта Лакричника А.М.

Кроме того, количество ревертантных колоний в положительных и отрицательных контролях было сравнимо с исходными данными.

Основываясь на полученных результатах, сделали вывод, что Экстракт Лакричника А.М. не является мутагеном.

Рекомендации по применению

Экстракт Лакричника А.М. рекомендуется для использования в таких продуктах как зубные пасты и жидкости для полоскания ротовой полости.

Стандартная концентрация в конечном продукте 0.05–0.1%.